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不同孵育温度对应用ELISA法检测PRRS抗体效价的影响
来源:微信公众号发布时间:2019年06月17日

图片来源:https://www.pexels.com/zh-cn/

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and respiratory syndrome,PRRS)俗称蓝耳病,是由猪繁殖与呼吸综合征病毒引起的一种主要以母猪繁殖障碍、仔猪呼吸道症状以及断奶仔猪高死亡率为特征的病毒性传染病。2006年夏以来,主要由PRRS病毒引起的以高热、呼吸困难为主要症状,高发病率和高死亡率为显著特征的猪“高热”综合征,给我国养猪业带来巨大的经济损失。安全、高效的疫苗和准确、可靠的检测技术是预防和控制该病的关键。

酶联免疫吸附试验(Enzyme –linked immunosorbent assay,ELISA)具有产品(试剂)稳定、操作相对简单、灵敏性好等优点,成为目前免疫测定技术中应用最广泛的一项技术。本文以检测PRRS抗体为例设计试验,探讨不同孵育温度对应用ELISA法检测PRRS抗体效价的影响。

1 材料与方法

1.1 样本 选取经过PRRS疫苗免疫后呈现不同抗体效价的猪血清30份。

1.2 试剂 PRRS抗体检测试剂盒(IDEXX)。

1.3 仪器 微量移液器、恒温恒湿箱、洗板机、酶标仪。

1.4 方法 将经过PRRS疫苗免疫后呈现不同抗体效价的猪血清30份进行编号(1-30号)后加样。3块抗原包被板加样顺序相同,加样顺序如下图所示(阴性、阳性对照及样品均加2孔)。

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整个试验严格按照试剂盒说明书操作,在室温(温度25℃、湿度65%)条件下,由同一人在同一时间进行试验,3块板孵育温度不同(每块板加样相差7分钟)。板1在15℃孵育,板2在25℃孵育(试剂盒推荐温度),板3在37℃孵育。

2 结果

2.1 样品OD值

根据试验有效性判定条件(OD(-)≤0.15,且OD(+)-OD(-)≥0.15),3个试验均成立,结果均有效。阴性对照、阳性对照和样品的OD值见表1和图1。(注:“-”为阴性对照,“+”为阳性对照)

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2.2 样品S/P值

根据公式计算出样品S/P值:

。判定标准如下,阴性:S/P<0.4,阳性:S/P≥0.4。各样品的S/P值及阴阳性判定见表2和图2。

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3 讨论

3.1 样品OD值

本试验中选择的PRRS抗体检测试剂盒,反应原理是间接ELISA。从表1和图1可以看出,孵育温度升高,样品中PRRS抗体与板上包被的抗原以及二抗等结合或反应更加充分,结果似乎是样品OD值会随着孵育问题升高而升高。

当然,不含PRRS抗体或含有少量PRRS抗体的样品,随着孵育温度升降,OD值升降比较有限,如图表中的阴性对照和OD值小于0.1的样品。而含有PRRS抗体较多的样品,随着孵育温度升降,OD值升降比较明显,如图表中的阳性对照和OD值大于0.4的样品。故样品OD值随孵育温度升降的幅度还与样品自身含有PRRS抗体多少有关。

3.2 样品S/P值

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结合表2和图2中的数据可以看出,孵育温度的变化对样品OD值有影响,导致样品S/P值也有变化:如果S/P值处于0.4附近,孵育温度的改变可能会引起样品S/P值阴阳性的变化;如果S/P值在2或以上,孵育温度的降低可能会引起样品S/P值的上升。这些都会影响兽医工作者对PRRS抗体水平的判断。

3.3 实验条件和环境控制

由于检测结果受到实验室各种因素的影响,建议在实验室的日常检测操作过程中,合理把握时间,严格按照说明书进行操作,尽量避免环境温度、孵育温度等因素对检测结果的影响。通过配置硬件,保持环境的恒定,完善检测细节,减少系统误差,这样让检测结果更为可靠,为临床生产提高更加准确可靠的分析和预警提醒。

寒冷和酷暑季节,都要注意温度的控制,确保检测结果准确可信,同时也避免不太准确的检测结果误导生产。

李静,华南农业大学兽医学院临床兽医学硕士,现就职于广东永顺生物制药股份有限公司客户服务部检测试验室,主要从事实验室检测等相关工作。

江鹏华,毕业于佛山科学技术学院动物医学系,现就职于广东永顺生物制药股份有限公司技术服务部检测实验室,主要从事实验室检测及相关工作。

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